پروتئازها به عنوان یکی از مهم ترین گروه های آنزیمی صنعتی، سهمی حدود 60 درصد از بازار جهانی آنزیم ها را به خود اختصاص داده اند. قابلیت هیدرولیز پیوندهای پپتیدی، کاربردهای گسترده ای را در صنایعی همچون شوینده، داروسازی، غذایی، چرم سازی و نساجی برای این آنزیم ها به ارمغان آورده است. با این وجود، پایداری ناکافی بسیاری از پروتئازهای طبیعی در شرایط سخت فرآیندی نظیر دماهای بالا، سطوح نامطلوب pH و حضور ترکیبات شیمیایی، چالشی عمده در بهره برداری صنعتی از آن ها محسوب می شود. هدف از این مطالعه، بهبود ویژگی های عملکردی و پایداری پروتئاز از طریق جهش زایی شیمیایی در سویه ی باکتریایی مولد بود. در این پژوهش، سویه ی باکتریایی منتخب از جنس Bacillus halotolerans به عنوان سویه ی والد در محیط کشت LB مایع کشت داده شد و به منظور القای جهش، در معرض غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر از اتیدیوم بروماید (EtBr) به مدت 120 دقیقه قرار گرفت. پس از تیمار جهش زا، کلونی های حاصل بر روی محیط اسکیم میلک آگار کشت داده شدند و غربالگری اولیه بر اساس شاخص نسبت قطر هاله ی هیدرولیز به قطر کلونی (H/C) انجام پذیرفت. بر این اساس، 46 کلونی برتر که دارای بیشترین فعالیت پروتئازی بودند، انتخاب و در سه گروه A) بالاترین قطر هاله(، B )مقدار متوسط (و T) کمترین قطر هاله( دسته بندی شدند. سنجش کمی فعالیت آنزیمی با استفاده از روش استاندارد هیدرولیز کازئین و اندازه گیری جذب نوری در طول موج 660 نانومتر انجام شد. بر اساس نتایج هفت کلونی برتر شامل A1، A4،A13،T1،A14،A20،T26،T19 شناسایی شد که فعالیت پروتئازی آن ها بین 2 تا 3 برابر بیش از سویه ی والد بود. ارزیابی پایداری آنزیمی در شرایط سخت )دمای 95 درجه سانتی گراد و 8/5 (pH=نشان داد که آنزیم تولیدشده توسط کلونیA4 با دارا بودن فعالیت U/g 83422، پایداری حرارتی و قلیایی بسیار بالاتری را در مقایسه با آنزیم سویه ی والد U/g) 33733 (نشان می دهد. به منظور شناسایی تغییرات مولکولی، DNA ژنومی کلونی های منتخب استخراج و ژن کدکننده ی پروتئاز (aprE) با استفاده از تکنیک واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) تکثیر گردید. محصولات PCR پس از خالص سازی، توالی یابی شدند. مقایسه ی توالی های به دست آمده با توالی مرجع، وقوع جهش های نقطه ای منجر به تغییرات آمینواسیدی را تأیید نمود. در کلونیA4، جایگزینی سیستئین با سرین در موقعیت 168 و جایگزینی آرژنین با لیزین در موقعیت 324 مشاهده شد. همچنین، در کلونی هایA20 و T19، تغییرات مشابه و اضافی از جمله جایگزینی سرین با سیستئین و هیستیدین با سرین شناسایی گردید. به نظر می رسد این تغییرات آمینواسیدی، به ویژه جایگزینی های مرتبط با سیستئین، از طریق تأثیر بر تشکیل پیوندهای دی سولفیدی، نقش مستقیمی در افزایش پایداری ساختاری آنزیم در برابر حرارت ایفا کرده اند. به طور کلی، یافته های این تحقیق مؤید آن است که جهش زایی شیمیایی با اتیدیوم بروماید، روشی کارآمد و مقرون به صرفه برای ایجاد تنوع ژنتیکی و بهبود عملکرد پروتئازهای باکتریایی است. نتایج این مطالعه می تواند در توسعه ی سویه های صنعتی مقاوم و تولید پروتئازهای پایدار با کارایی بالا در شرایط سخت فرآیندی مورد بهره برداری قرار گیرد.
واژگان کلیدی: پروتئاز، جهش زایی شیمیایی، اتیدیوم بروماید، پایداری آنزیم، Bacillus halotolerans ، PCR، توالی یابی ژن