این پژوهش با هدف تولید و بهینه سازی فرم نوترکیب آنزیم T7 RNA پلیمراز (T7RNAP) به عنوان یکی از ابزارهای کلیدی در زیست فناوری مدرن انجام شد. این آنزیم به طور گسترده در سنتز RNA، توسعه واکسن های mRNA، سامانه های بیان پروتئین و مطالعات بیولوژی مولکولی کاربرد دارد. محدودیت های موجود در دسترسی به آنزیم تجاری در کشور، هزینه های بالا و وجود ناخالصی هایی نظیر گلیسرول که بر کارایی سامانه های بدون سلول تأثیر منفی می گذارد، ضرورت تولید نسخه بومی و مقرون به صرفه این آنزیم را دوچندان می کند. در این تحقیق، ابتدا ژن کدکننده T7RNAP از فاژ T7 در وکتورهای pAK-T7RNAP و pET28a-T7RNAP همسانه سازی و به سویه های مختلف E. coli (DH5 برای تکثیر پلاسمید و BL21 برای بیان پروتئین) منتقل شد. به منظور افزایش بازده تولید، بیان آنزیم در شرایط مختلف از جمله دماهای متفاوت (37 و 20 درجه سانتی گراد) بررسی گردید. نتایج نشان داد که کاهش دما به 20 درجه سانتی گراد نه تنها پایداری و حلالیت پروتئین را افزایش داد، بلکه امکان تولید مقادیر بیشتری از پروتئین نوترکیب محلول را فراهم کرد. خالص سازی پروتئین از طریق سیستم های مبتنی بر برچسب هیستیدینی و کروماتوگرافی موفقیت آمیز بوده و غلظت نهایی پروتئین خالص به حدود 7 میلی گرم از 80 میلی لیتر محیط کشت رسید که بیانگر ظرفیت تولید در مقیاس صنعتی است. برای بررسی عملکرد، آنزیم نوترکیب در واکنش های رونویسی آزمایشگاهی مورد آزمون قرار گرفت. نتایج نشان داد که این آنزیم فعالیتی قابل مقایسه با نمونه های تجاری دارد و RNA با طول مورد نظر را با دقت بالا سنتز می کند. یکی از یافته های مهم، عدم تشکیل محصولات RNA غیر اختصاصی بود؛ مشکلی که در آنزیم های تجاری به ویژه به دلیل حضور گلیسرول بالا مشاهده می شود. بررسی های تکمیلی نشان داد که افزودن گلیسرول در غلظت های بیش از 10 می تواند باعث تولید RNAهای ناخواسته و کاهش کیفیت محصول گردد. همچنین، استفاده از DNA حلقوی نسبت به DNA خطی بازده بالاتری در سنتز RNA داشت که می تواند راهبردی مؤثر در طراحی الگوهای آینده باشد. یافته های این پژوهش تأیید می کند که تولید آنزیم T7RNAP در کشور امکان پذیر است و آنزیم حاصل از لحاظ خلوص، کارایی و قابلیت استفاده در سامانه های Cell-free پروتئین، برتر از نمونه های وارداتی حاوی گلیسرول عمل می کند. اهمیت این نتیجه در کاهش هزینه ها، استقلال علمی و صنعتی، و فراهم سازی زیرساختی پایدار برای توسعه فناوری های نوین همچون واکسن های mRNA، درمان های مبتنی بر RNA و نانوزیست فناوری برجسته است. به طور کلی، این تحقیق نه تنها یک مسیر عملی برای تولید آنزیم های کلیدی زیست فناوری را ارائه می دهد، بلکه زمینه ساز توسعه روش های نوآورانه در بیان پروتئین، سنتز RNA و کاربردهای درمانی آینده خواهد بود. نتایج به دست آمده ظرفیت بالای این آنزیم را در پاسخ گویی به نیازهای پژوهشی و صنعتی کشور نشان می دهد و می تواند بستری برای تولید کیت ها و فرآورده های مبتنی بر RNA در مقیاس ملی فراهم سازد.
کلمات کلیدی: آنزیم T7 RNA پلیمراز، سنتز RNA، زیست فناوری، پروتئین نوترکیب، واکسن های mRNA