بیماری ساق سیاه و پوسیدگی نرم سیب زمینی از مهم ترین بیماری های سیب زمینی محسوب می شوند كه در مزرعه و مراحل پس از برداشت، خسارت قابل توجهی به این محصول وارد می كنند. این بیماری ها توسط گونه هایی از دو جنس باكتریایی Pectobacterium و Dickeya ایجاد می شوند كه در سال های اخیر و به دلیل افزایش دمای اقلیمی، گونه های گرمادوست P. parmentieri (Pp)، P. brasiliense (Pbr) و (Dsol) D.solani انتشار بیشتری در مزارع جهان و نیز ایران پیدا كرده اند. به دلیل یكسان بودن فرایند تولید غده های خوراكی و بذری سیب زمینی درایران، احتمال آن وجود دارد كه این عوامل بیمارگر باكتریایی از مناطق آلوده به سایر نواحی كشت سیب زمینی نیز منتقل شوند. بنابراین، كسب اطمینان از عدم آلودگی غده های بذری سیب زمینی به این باكتری های بیمارگر، برای برای كاهش شیوع بیماری های ساق سیاه و پوسیدگی نرم در كشور لازم است. به این لحاظ، دستیابی به یك روش كار آمد و ساده برای ردیابی سریع Pp، Pbr و Dsol در غده های بذری سیب زمینی، به عنوان هدف اصلی این پژوهش در نظر گرفته شد . به این منظور، ابتدا دو جدایه P7 و P60 از Pp، L4 و P63 از Pbr و نیز Dh12 و D2222 از Dsol برای انجام آزمایشات اولیه انتخاب شدند. هیچكدام از این جدایه ها در 5 توانایی ایجاد پوسیدگی نرم در برشهای غده سیب زمینی را نداشتند، ولی علایم بیماری در 28 برای تمام جدایه ها شدید بود. پیشرفت لهیدگی جدایه های Dsol در دمای 35 نسبت به جدایه های Pp وPbr بیشتر ارزیابی شد. پس از به كارگیری روش های استاندارد باكتری شناسی و اطمینان از همسانی ویژگی های مورفوژیكی، بیماری زایی، فیزیولوژیكی و بیوشیمیایی جدایه های هرگونه، سه جدایه P60 از Pp، L4 از Pbr و نیز Dh12 از Dsol برای انجام آزمون های ردیابی مولكولی باكتری به روش Multiplex-PCR انتخاب شدند. پس از استخراج DNA از جدایه ها به دو روش CTAB و جوشانیدن ، ابتدا تكثیر باند مورد نظر DNA این باكتری ها به ترتیب با جفت آغازگرهای اختصاصی Pw7011F/R برای Pp (bp 140)، BR1F/R برای Pbr (bp 322) و DSF1/DSR2 (bp 895) تایید شد. در مراحل بعد و طی آزمون های مكرر، با استفاده از روش رقیق كردن متوالی DNA جدایه ها و جفت آغازگرهای اختصاصی و نیز تغییر دمای اتصال آغازگرها در آزمون های Gradient-PCR ، غلظت بهینه DNA، غلظت جفت آغازگرها و دمای اتصال واكنش برای انجام آزمون های Duplex-PCR و Multiplex-PCR بررسی گردید. بر اساس نتایج بدست آمده، غلظت 40ng/l از DNA هر باكتری، به كارگیری غلظت pmol 10 از هر آغازگر، افزودن 25mM از Mg Cl2 به عنوان مقادیر بهینه هر مخلوط واكنش 20 میكرولیتری و استفاده از دمای اتصال 62 و دمای گسترش 65 در انجام هر واكنش ، برای تكثیر قطعات DNA مورد انتظار آزمون های PCR، Duplex PCR و Triplex PCR تعیین شد. در تعیین كارآیی آزمون های سه گانه PCR برای ردیابی باكتری های Pp، Pbr و Dsol از غده های آلوده، ابتدا، سوسپانسیونی از هر جدایه به صورت انفرادی، مخلوط دوتایی و مخلوط سه تایی در غده های جداگانه مایه زنی شدند. پس از بروز لهیدگی در بافت غده ها، یك گرم از بافت لهیده هر تیمار برای استخراج DNA بكار رفت و سپس واكنش های PCR، Duplex PCR و Triplex PCR برای هر تیمار انجام گرفت. نتایج نشان داد كه روش های بهینه سازی شده Multiplex PCR می تواند بصورت دقیق و با با كیفیتی مناسب باكتری های هدف را در غده های آلوده شناسایی كند. در مجموع، می توان گفت امكان ردیابی منفرد و یا همزمان سه جدایه Pp، Pbr و Dsol از غده های سیب زمینی با روش بهینه سازی شده Multiplex-PCR در این پژوهش موفقیت آمیز بود. بنظر می رسد روش های Multiplex-PCR توسعه یافته در این پژوهش برای غربالگری غده ها ی سیب زمینی از نظر آلودگی به باكتریهای Pp، Pbr و Dsol به لحاظ اهداف قرنطینه ای و نیز صدور گواهی سلامت بذر مفید واقع شود.

كلمات كلیدی: ساق سیاه و پوسیدگی نرم سیب زمینی، Pectobacterium spp.، ،Duplex PCR، Triplex-PCR