بیماری ساق سیاه و پوسیدگی نرم سیب زمینی از مهم ترین بیماری های سیب زمینی محسوب می شوند که در مزرعه و مراحل پس از برداشت، خسارت قابل توجهی به این محصول وارد می کنند. این بیماری ها توسط گونه هایی از دو جنس باکتریایی Pectobacterium و Dickeya ایجاد می شوند که در سال های اخیر و به دلیل افزایش دمای اقلیمی، گونه های گرمادوست P. parmentieri (Pp)، P. brasiliense (Pbr) و (Dsol) D.solani انتشار بیشتری در مزارع جهان و نیز ایران پیدا کرده اند. به دلیل یکسان بودن فرایند تولید غده های خوراکی و بذری سیب زمینی درایران، احتمال آن وجود دارد که این عوامل بیمارگر باکتریایی از مناطق آلوده به سایر نواحی کشت سیب زمینی نیز منتقل شوند. بنابراین، کسب اطمینان از عدم آلودگی غده های بذری سیب زمینی به این باکتری های بیمارگر، برای برای کاهش شیوع بیماری های ساق سیاه و پوسیدگی نرم در کشور لازم است. به این لحاظ، دستیابی به یک روش کار آمد و ساده برای ردیابی سریع Pp، Pbr و Dsol در غده های بذری سیب زمینی، به عنوان هدف اصلی این پژوهش در نظر گرفته شد . به این منظور، ابتدا دو جدایه P7 و P60 از Pp، L4 و P63 از Pbr و نیز Dh12 و D2222 از Dsol برای انجام آزمایشات اولیه انتخاب شدند. هیچکدام از این جدایه ها در 5 توانایی ایجاد پوسیدگی نرم در برشهای غده سیب زمینی را نداشتند، ولی علایم بیماری در 28 برای تمام جدایه ها شدید بود. پیشرفت لهیدگی جدایه های Dsol در دمای 35 نسبت به جدایه های Pp وPbr بیشتر ارزیابی شد. پس از به کارگیری روش های استاندارد باکتری شناسی و اطمینان از همسانی ویژگی های مورفوژیکی، بیماری زایی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی جدایه های هرگونه، سه جدایه P60 از Pp، L4 از Pbr و نیز Dh12 از Dsol برای انجام آزمون های ردیابی مولکولی باکتری به روش Multiplex-PCR انتخاب شدند. پس از استخراج DNA از جدایه ها به دو روش CTAB و جوشانیدن ، ابتدا تکثیر باند مورد نظر DNA این باکتری ها به ترتیب با جفت آغازگرهای اختصاصی Pw7011F/R برای Pp (bp 140)، BR1F/R برای Pbr (bp 322) و DSF1/DSR2 (bp 895) تایید شد. در مراحل بعد و طی آزمون های مکرر، با استفاده از روش رقیق کردن متوالی DNA جدایه ها و جفت آغازگرهای اختصاصی و نیز تغییر دمای اتصال آغازگرها در آزمون های Gradient-PCR ، غلظت بهینه DNA، غلظت جفت آغازگرها و دمای اتصال واکنش برای انجام آزمون های Duplex-PCR و Multiplex-PCR بررسی گردید. بر اساس نتایج بدست آمده، غلظت 40ng/l از DNA هر باکتری، به کارگیری غلظت pmol 10 از هر آغازگر، افزودن 25mM از Mg Cl2 به عنوان مقادیر بهینه هر مخلوط واکنش 20 میکرولیتری و استفاده از دمای اتصال 62 و دمای گسترش 65 در انجام هر واکنش ، برای تکثیر قطعات DNA مورد انتظار آزمون های PCR، Duplex PCR و Triplex PCR تعیین شد. در تعیین کارآیی آزمون های سه گانه PCR برای ردیابی باکتری های Pp، Pbr و Dsol از غده های آلوده، ابتدا، سوسپانسیونی از هر جدایه به صورت انفرادی، مخلوط دوتایی و مخلوط سه تایی در غده های جداگانه مایه زنی شدند. پس از بروز لهیدگی در بافت غده ها، یک گرم از بافت لهیده هر تیمار برای استخراج DNA بکار رفت و سپس واکنش های PCR، Duplex PCR و Triplex PCR برای هر تیمار انجام گرفت. نتایج نشان داد که روش های بهینه سازی شده Multiplex PCR می تواند بصورت دقیق و با با کیفیتی مناسب باکتری های هدف را در غده های آلوده شناسایی کند. در مجموع، می توان گفت امکان ردیابی منفرد و یا همزمان سه جدایه Pp، Pbr و Dsol از غده های سیب زمینی با روش بهینه سازی شده Multiplex-PCR در این پژوهش موفقیت آمیز بود. بنظر می رسد روش های Multiplex-PCR توسعه یافته در این پژوهش برای غربالگری غده ها ی سیب زمینی از نظر آلودگی به باکتریهای Pp، Pbr و Dsol به لحاظ اهداف قرنطینه ای و نیز صدور گواهی سلامت بذر مفید واقع شود.

کلمات کلیدی: ساق سیاه و پوسیدگی نرم سیب زمینی، Pectobacterium spp.، ،Duplex PCR، Triplex-PCR