ابوذر سورنی
آنزیم های صنعتی مانند پروتئاز، آمیلاز و فیتاز به عنوان کاتالیزورهای زیستی نقش کلیدی در فرآیندهای صنعتی ایفا می کنند، اما پایداری و کارایی آن ها تحت شرایط سخت صنعتی اغلب محدود است. در این پژوهش، با استفاده از روش های بیوانفورماتیکی پیشرفته، جهش های هدفمندی در نقاط داغ عملکردی این آنزیم ها طراحی شد تا ویژگی های آنزیمی از جمله پایداری حرارتی، حلالیت و فعالیت کاتالیزوری بهبود یابد. ابتدا توالی ها و ساختارهای سه بعدی آنزیم های هدف از پایگاه های داده RCSB و UniProt استخراج شد و با استفاده از الگوریتم CD-HIT توالی های تکراری حذف گردیدند. سپس با تحلیل شبکه تشابه توالی(SSN) و ترسیم ماتریس تشابه، گروه های عملکردی مرتبط شناسایی شدند. برای شناسایی دقیق نقاط داغ، از ابزار HotSpot Wizard 3.0 استفاده شد که با بررسی فاکتور B و محاسبه انرژی آزاد گیبس (G)، اسیدآمینه های کلیدی در پایداری و عملکرد آنزیم ها را مشخص کرد. مدل سازی ساختار سه بعدی پروتئین های جهش یافته با نرم افزار AlphaFold2 انجام گرفت و کیفیت ساختارها با شاخص های pLDDT و PAE ارزیابی شد. داکینگ مولکولی با استفاده از AutoDock Vina و شبیه سازی مولکولی با استفاده از GROMACS به منظور بررسی پایداری ساختاز آنزیم انجام شد. در این مطالعه 9 نقطه داغ عملکردی در آمیلاز و 7 نقطه داغ در فیتاز شناسایی شد که بیشتر در نواحی کاتالیتیک و اتصال به سوبسترا قرار داشتند. در آنزیم آمیلاز، اسیدهای آمینه کلیدی شامل Glu251، Asp373 و Arg443 بودند که در حفظ ساختار دوم پروتئین و برهمکنش با سوبسترا نقش حیاتی ایفا می کردند. به ویژه، جایگاه Glu251 در تشکیل پیوندهای هیدروژنی با سوبسترا و Arg443 در ایجاد برهمکنش های الکترواستاتیک مؤثر بودند. در فیتاز، اسیدهای آمینه Lys48، Asp230 و Phe323 به عنوان نقاط داغ شناسایی شدند که Lys48 در مرکز فعال آنزیم و Asp230 در پایداری ساختاری در pH اسیدی نقش کلیدی داشتند. شبیه سازی دینامیک مولکولی نشان داد جهش Glu251Lys در آمیلار و Lys48Pro در فیتاز به ترتیب منجر به کاهش 15% و 14% در نوسانات ساختاری(RMSD) شدند. همچنین، این جهش ها بهبود قابل توجهی در انرژی اتصال آنزیم به سوبسترا ایجاد کردند، به طوری که انرژی اتصال در آمیلاز جهش یافته از( 5/6-) به( 9/6- )کیلوکالری بر مول و در فیتاز از( 3/6- ) به( 7-)کیلوکالری بر مول رسید. این نتایج نشان می دهد که هدف قرار دادن این نقاط داغ می تواند استراتژی مؤثری برای بهینه سازی آنزیم های صنعتی باشد.
کلمات کلیدی: آنزیم، نقاط داغ عملکردی،آمیلاز، فیتاز، داکینگ مولکولی، شبیه سازی مولکولی