ریزوباکتری های محرک رشد گیاه (PGPR) به عنوان عوامل زیستی کلیدی در کشاورزی پایدار، نقش محوری در افزایش جذب مواد مغذی، تولید فیتوهورمون ها، سرکوب پاتوژن ها و القای مقاومت سیستمیک ایفا می کنند. این پژوهش با هدف شناسایی مولکولی گونه های منتخب جنس Bacillus شامل B. amyloliquefaciens، B. megaterium و B. pumilus از خاک ریزوسفر گیاه گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) تیمارشده با باکتری های مذکور، انجام شد. توالی ژن های 16S rRNA و 23S rRNA از پایگاه NCBI دریافت شد و پس از هم ترازسازی با نرم افزار MEGA11 و الگوریتم ClustalW، آغازگرهای اختصاصی گونه محور BA23، BM23 و BP23 بر اساس نواحی متغیر ژن 23S rRNA طراحی گردید. اختصاصی بودن آغازگرها با ابزارهای Oligo7، Oligo Analyzer و Primer-BLAST ارزیابی شد. نمونه برداری از خاک ریزوسفر در عمق 15-10 سانتی متری انجام شد و باکتری ها با رقیق سازی سریالی و کشت در محیط Nutrient Agar جداسازی شدند. استخراج DNA ژنومی با پروتکل CTAB-فنول-کلروفرم بهینه سازی شد و کیفیت آن با الکتروفورز ژل آگارز %7/0 تأیید شد. واکنش PCR با شیب دمایی 61-51 درجه ی سلسیوس برای تعیین دمای اتصال بهینه اجرا شد و در نهایت محصولات با روش Sanger توالی یابی گردیدند. تحلیل فیلوژنتیک با روش Maximum Likelihood و پارامترهای حذف جزئی انجام گرفت و گونه P. libanensis به عنوان گروه خارجی استفاده شد. نتایج نشان داد که آغازگرهای طراحی شده قطعات مورد انتظار (حدود 600-900 جفت باز) را به صورت اختصاصی تکثیر کردند و واکنش متقاطع با DNAهای غیر هدف نداشتند. درخت فیلوژنتیک نزدیکی گونه های B. amyloliquefaciens و B. subtilis را با تشابه بیش از %4/99 نشان داد، در حالی که فاصله ژنتیکی با P. libanensis بیش از %22 بود. تحلیل BLASTn همسانی بیش از %99، پوشش %100 و E-value صفر را برای گونه های هدف تأیید کرد. با این حال، چالش هایی مانند ناهمخوانی در شناسایی B. megaterium به دلیل همسانی ژنتیکی بالا در کمپلکس گونه ای Bacillus مشاهده شد، که محدودیت های روش های مبتنی بر rRNA را برجسته می سازد. این پژوهش ابزارهای مولکولی کارآمدی برای شناسایی سریع PGPRها ارائه داد که پتانسیل کاربرد در تولید کودهای زیستی و کنترل بیولوژیکی را دارد. یافته ها بر لزوم ترکیب نشانگرهای مکمل مانند gyrB برای غلبه بر محدودیت های تاکسونومیک تأکید می کنند و پیشنهاد می شود تحقیقات آینده بر توسعه سیستم های Multiplex PCR و ارزیابی تأثیر تغییرات اقلیمی بر جمعیت Bacillus تمرکز یابند.
کلمات کلیدی: ریزوباکتری های محرک رشد گیاه، جنس Bacillus، شناسایی مولکولی، آغازگرهای اختصاصی، تحلیل فیلوژنتیک، 23S rRNA،16S rRNA .