گندم (Triticum aestivum L.) به عنوان یکی از اعضای خانواده گرامینه (Poaceae)، نقش مهمی در امنیت غذایی جهانی و تجارت بین المللی غلات دارد. از مهم ترین بیماری های بذرزاد گندم، بیماری های سیاهک پنهان گندم، ناشی از گونه های Tilletia هستند. این بیمارگر ها علاوه بر کاهش عملکرد و کیفیت محصول، تجارت بین المللی غلات را نیز به دلیل مقررات سختگیرانه قرنطینه ای، محدود می کنند. روش های تشخیصی متداول شامل شناسایی مورفولوژیک و روش های مبتنی بر PCR، یا زمان بر بوده، یا نیازمند تخصص فنی بالا هستند و یا برای کاربردهای سریع و دقیق در مزرعه مناسب نمی باشند. در سال های اخیر، تکثیر هم دما به واسطه حلقه (LAMP) به عنوان روشی سریع، حساس و سازگار با شرایط میدانی برای شناسایی بیمارگرهای گیاهی مطرح شده است. این مطالعه با هدف به کارگیری LAMP برای شناسایی سریع و دقیق عوامل سیاهک پنهان گندم در ایران، به ویژه T. controversa، انجام شد. توان تشخیصی این آزمون با استفاده از نمونه های قارچی متعدد، ارزیابی و با روش های مرسوم PCR مقایسه گردید. هشت گونه از قارچ های مولد سیاهک از جمله چهار گونه مختلف جنس Tilletia در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفتند. استخراج DNA با استفاده از چهار روش متداول شامل موری و تامسون، ریدر و برودا، کلکس100 و هات شات انجام گرفت. هرچند باندهای DNA پس از استخراج به طور مستقیم روی ژل آگارز قابل مشاهده نبودند، اما PCR با آغازگرهای عمومی قارچی (ITS1/ITS4) حضور و کیفیت DNA را تأیید نمود. همچنین، PCR با آغازگرهای خارجی LAMP (F3/B3)، وجود ناحیه هدف و اختصاصیت آغازگرها را نشان داد. واکنش های LAMP با استفاده از مجموعه آغازگرهایی که پیش تر توسط صداقت جو و همکاران (2021) طراحی شده بودند، انجام شد. رنگ Neutral red به عنوان شناساگر استفاده گردید و نتایج با الکتروفورز ژل آگارز تأیید شدند. هر چهار روش استخراج، DNA الگوی با کیفیت و کمیت کافی برای استفاده در PCR و LAMP فراهم کردند. آزمون LAMP به طور اختصاصی T. controversa را شناسایی نمود، به طوری که واکنش های حاوی ژنوم آن، همواره مثبت بوده و تغییر رنگ واضحی از نارنجی به صورتی نشان دادند. همچنین الگوی نردبانی که مشخصه تکثیر با روش LAMP است، روی ژل آگارز نشان داده شد. کنترل های منفی شامل سایر قارچ های مولد سیاهک و کنترل فاقد DNA الگو هیچ تکثیر و تغییر رنگی نشان ندادند. آزمونLAMP توسعه یافته برای شناسایی T. controversa، به عنوان روشی سریع، اختصاصی و حساس ثابت شد. این روش بسیاری از محدودیت های روش های متداول را برطرف می سازد. دقت بالای این روش، همراه با امکان مشاهده ی نتایج در لحظه، آن را برای کاربرد در بازرسی های قرنطینه ای و مراکز گواهی بذر در ایران مناسب می سازد. این مطالعه ظرفیت آزمون LAMP را به عنوان روشی کاربردی برای تشخیص سیاهک کوتوله گندم نشان داده و زمینه را برای ادغام آن در برنامه های بهداشت گیاهی فراهم می نماید.
کلیدواژه ها: Tilletia controversa، سیاهک پنهان گندم، تکثیر هم دما به واسطه حلقه (LAMP)، استخراج DNA، تشخیص مولکولی؛ سلامت بذر؛ شناسایی قرنطینه ای